Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері

Сомалық будандастыру әдісі табиғи емес,толығымен жасанды болғандықтан,өзіне ғалымдардың назарын аударып,гендердің бірегей тіркестерін алуға үміттендіреді,жыныстық жолмен будандаспайтын өсімдіктерден гендердің жаңа жиынтығы бар сомалық будандар алуға жол ашады.

Сомалық будандастыру өте күрделі, нәтижесін алдын ала болжауға болмайтын және тікелей басқаруға көнбейтін процесс.Сомалық будандардың генотипі генетикалық өзгерістерге жеткізетін бірқатар уақиғалардың нәтижесі. Екі протопласт құйылысқан кезде,бір-біріне тәуелсіз және әр уақытта ядролар,хлоропластар,митохондрялар өзара қосылып,генетикалық информациямен алмасуы мүмкін.Бірақ уақиғабасқаша өтуі де әбден мүмкін:ядролар қосылмайды,органеллелер да қосылмайды,кейбір органоидтар тіпті бұзылып кетеді.Қосылған протопластар өсірген уақытта митоздың барысында ядро мен органоидтардың сегрегациясы (бөлініп шығарылуы),бірен-сарандаған хромосомалардың жойылуы (элиминациясы),кейбір оргоноидтардың ішінара(селективтік)көбеюі мүмкін.Сонымен қатар,бұл жағдайларға, будандас- тыру процесіне байланысты генетикалық тұрақсыздық пен мутациялық өзгергіштік қосылуы мүмкін.

Будан клеткалардың дұрыс түзілуіне бірқатар факторлар кедергі бола алады:1)қосылатын компонентерді фюзогенмен өңдеу кезінде пайда болатын тұрақсыздық ;2)қосылатын протопластардың бір түрінде немесе екеуінде де өсіру тығыздығы төмен;3)ядролардың асинхронды бөлінуі;4)вакольдердебола цитоплазманың толық қосылмауы;5)бірнеше митоздан соң хромосомалардың жоғалуы;6)будан клеткалардың өсіру тығыздығы төмен болғандықтан құруы.

Сомалақ клеткаларды будандастыру кезінде гендер тағдыры көптеген факторларға байланысты,ол өкінішке орай әлі жақсы зерттелмеген.Өсімдіктердің клеткалық инжинериясының дамуына украин ғалымы Ю.Ю.Глеба үлкен үлесін қосты.Ол 25 жылдан астам уақыт онымен айналысқан,сомалық будандастырудың генетикалық мәселелерін,әсіресе ата-аналық формаларының ядролық және цитоплазмалық гендерін зерттеп келеді.

Жыныстық жолмен алынған будандардан айнымайтын сомалық буданды гаплоидтық клеткаларды құйылыстырып шығаруға болады.Жоғарыда айтылған- дай,тәжірибені өз кезінде Г.Мельхере мен Г.Лабиб темекінің екі түрінің андрогендік гаплоидтардан бөлініп алынған протопластарымен өткізген.

Бірақ эксперименттердің көбінде кәдімгі сомалық клеткалар пайда- ланылады.Егер протопластар ядролары қосылса,олар амфидиплоидтық болулары керек,яғни екі ядроның диплоидтық хрмосомалар жиынтықтары қосылады.Бірақ түрлі өсімдіктердің зерттелген сомалық будандарында амфидиплоидтық хромосомалар жиынтығы болмаған.

Ю.Ю.Глеба әріптестерімен темекінің бір түрінің протопластарында сомалық будандастыру кезінде ядролық гендердің жүріс-тұрысын зерттеген.Олар құйылысқан протопластарды миханикалық жолмен бөліп алып,оларды бөлек өсірген.Бұл тәсілдің арқасында жеке клеткаларда өтіп жатқан генетикалық оқиғаларды  және әрбір клонның көптеген ұрпақтарын зерттеуге болады.Ата аналық біреуі ретінде олар темекінің Ксанти сортының ескі каллус линиясын алған.Бұл линия морфогнезге қаблетін жоғалтқан және 5-метилтриптофанға шыдамды болған.Екінші ата-ана ретінде темекінің роза сортының мезофильдік амфигаплоидтық (n-24,әрбір ата-атаның хромосомалардың гаплоидтық жиынтығы бар) және амфидиплоидтық клеткалары алынды.Бұл клеткалар жарыққа сезімтал рецесивтік геннен гомозиготалар болған.Екі тәуелсіз тәжірибе механикалық әдіспен 13 каллус проотопластарымен құйылысқан гаплойтық мезофилл клеткалары және 12 каллус протопластарымен қосылған диплоидтық мезофилл клеткалары алынды.Бұдан басқа 12 каллус және 6 мезофилл протопластары оқшауланып алынды.Барлық қосылған клеткалар және жеке-жеке алынған ата-ана клеткалары каллус түзеп,кейін бүтін регенерант өсімдіктерін берді.Тек бір де бір протопластар құйылысынан пайда болған будан клетканың клоны жөнді өсімдік бермейді.Соымен қатар,бірінші ата-ана ретінде алынған темекінің (Ксанти сорты) клеткаларынан да регенерант шықпады,себебі ол морфогенезге қаблеттілігінен айырылған. Нәтижесінде пісіп-жетілген 350 өсімдік алынды(әрбір клетка клонынан 5-тен 25-ке дейін).Олар өздерінің қасиеттері бойынша А, Б, В деген үш топқа бөлінді.

А тобындағы өсімдіктер клеткалық клондардың төртеуінен алынған.Оларда ата-ананың екеуінің де белгілері болған. Сондағы каллус клеткалар белгілері:жарыққа төзімділік,триптофананың аналогына жарым-жартылай төзімділік,анеуплоидтық және хромосомалық тұрақсыздық.Роза сортының клеткаларының белгілері:нормалы морфогнез және жапырақтардың сағақсыз қондырмалы орналасуы.Бұл өсімдіктердің хромосомалық саны ата-аналарының хромосомалық жиынтығының қосындысына азды-көпті сәйкес келген.Сөйтіп,бұл өсімдіктер нағыз будан өсімдіктер болған,яғни протопластардың қосылуы негізінде олардың ядролары да қосылған.

Б тобында өсімдіктер клеткалық клондардың 14-нен алынған.олар морфология жағынан нормалы болған және барлық белгілері бойынша ата-ананың екеуінің біреуіне ұқсас болған.Күшті жарыққа өсіргенде олар түссізденген,яғни жарыққа төзімсіз болған.Клеткаларындағы хромосомаллық жиынтығы тек қана гаплоидтық немесе диплойтық болған.Бұл жәйт будан клеткаларда ата-ананың ядролары қосылмағанын көрсетеді.Регенерант өсімдіктері тек Роза сортының ядроларын иемденген клеткалардан пайда болған, себебі олардың морфогнезге қаблеті болған.

В тобындағы өсімдіктер құйылысқан екі протопластардан пайда болған будан клетканың клондарынан алынған.Бұл клондардан шыққан регинантардың ішінде әртүрлілік байқалған, яғни А.тобындағы өсімдіктерге ұқсас және Б тобындағы өсімдіктерге ұқсасатары болған. Гаплоидтық мезофилдің протопластарынан алынған Роза сортының өсімдіктеріне ұқсаған, тек қана регенераттардың  көбісі диплойдтық болып шыққан. 

Ю.Ю.Глеба осы тәжірбиелердің нәтижесінде  мынандай негізгі қорытынға келеді. Протопластарды  қосын будан өсімдіктерді алғанда, олардың  ядролық гендері  ата-ананың  екеуінен  қалай тұқым  қуаласа, солай – ақ біреуінен  де тұқым қуалай  алады. Ақырғысы, сірә, ядролар қосылмай, кейін гетерокариондарда сегрегацияға ұшырауына байланысты шығар.Бұл тұраралық және түрішіндегі комбинацияларында байқалады.Осындай тұжырымға басқа зерттеушілер де келді.

Г.Мельхере мен Г.Лабиб ядролары қосылған кезде хромосомалардың жүріс-түрысын анықтады.Олар темекі мезофилінен  алынған гаплоидтық про-топластарының құйылысуынан шыққан будандардың хромосомалық санын зерттейді.Темекі жапырағының мезофилл клеткалары  жалпы гомоплодты болады, ал гаплоидтық өсімдіктерде гаплоидтық болады.55 түр будан каллустардан шыққан регенерантардың ішінде 30-ы диплоидтық, 5-і үшплоидтық 6-ы тетраплоидтық болған. Бұдан басқа анеуплойдтар да болған.Соны-мен,буандардың көбі кәдімі ұрықты амфидиплоидтар болып шықты.Бұл жағдай клеткалар қосылғанда ядролардың да қосылуын дәлелдейді.Ал анеуплоидтар клеткаларында In vitro өсіргендегі генетикалық өзгергіштік себебіне пайда болған шығар.

Басқа ғалымдар темекінің,сасықмендуананың жақын туысарасындағы будандарын зерттеп,ұқсас нәтижелер алды. Демек, жақын туысты түрлерді сомалық будандастырғанда регенерант өсімдіктердің бір бөлігі ата-ананың хромосомалық жиынтығының қосындысы бар нормалы ұрпақта өсімдіктер болған.

Будан клеткадан шыққан регенеранттардың көбінде байқалатын амфидиплоидттық көрсеткіштен ауытқуы талай себептерге байланысты. Олар:1)анеуплоидтық және ата-ананың біреуінің немесе екеуінің де хромосомалақ тұрақсыздығы; 2)будан клеткаларды In vitro өсіргенде жағдайлар- дың онша лайықты болмауы;3)будан клеткаларда генетикалық прооцестердің үйлестірілмеуі (түраралық будандастыру кезінде).

Екі протопласт құйылысқанда олардың цитоплазмалары араласады.Ядродан тыс хлоропластар мен митохондриялардан гендер онша зерттеле қойған жоқ,сондықтан екі клетка қосылып кейін бөлінген кездегі цитоплазмада өтетін процестер жөнінде мағлұмат өте аз.

Цитоплазмадағы гендердің жүріс-тұрысын, оларда кодпен жазылған балгілерді зерттеп,анықтайды.Пластомада(клетканың барлық пластидтерінің гендері) атразин деген гербицитке,антибиотиктерге (стрептомицин, линкомицин, тенток син) төзімділік және рибулозобисфосфаткарбоксилазанның (РуБФК) үлкен бөлшекткрінің белоктары,хлоропласт полиппетидтерінің құрылымы генетикалық кодпен жазылған.Ал митохондрионда (клетканың барлық митохондриялық гендері) цитоплазмалық аталық ұрықсыздығы,гүлдің морфологиясы,АТФ-синтетаза комплексіндегі полипептидтерінің бір бөлігі,митохондрияның кейбір белоктарының құрылымы генетикалық кодпен жазылған.

Ю.Ю.Глеба қызметтестерімен мынадай тәжірибе өткізді.Темекінің Самсун сортының хлорофилден ақауы бар пластомды мутанттарынан (барлық клеткалардағы пластидтердің кемістігі болған) протопластарды бөліп ал-ған.Жабайы (нормалы) пластомы бар және цитоплазмалық аталық ұрықсыздық белгісі бар Дюбек-44 сортының протопластарын самсун сортының протопластарымен құйып қосады.Цитоплазмалық аталық ұрықсыздық белгісі фенотинге гүлдердің бір жыныстық (аталық гаметофиттері-тозаң қаптары жоқ)болуымен көрінген.Өсімдіктердің екеуінде де РуБФК полиппептидтеріне полиаккриламид гелінде изоэлекторфокустау арқылы биохимиялық талдау өткізілді.Екі ата-ананың РуБФК-ның үлкен бөлшекткріндегі айырмашылығы, кейін алынған сомалық будандардың биохимиялық талдауының негізі болды. Самсун сортының протопластарынан шыққан регенеранттары аппақ болған, Дюбек-44 сортында – жасыл болған, ал будан клеткалардан пайда болған алты өсімдіктер – ала жапырақ болған. Бұл өсімдіктердің клеткаларында хромосомалар саны есептелді. Сонда 4 өсімлік диплоидтық, біреуі тетраплоидтық (ядролар бойынша нағыз будан), тағы біреуі үшплоидтық болып шықты. Барлық ала жапырақты өсімдіктер бір жыныстық болды және оларды цитоплазмалық аталық ұрықсыздық белгісі болды. Ала жапырақты өсімдіктердің РуБФК-ның полипептидтерінің биохимилық талдауы оларда ата-ананың екеуінің де полипетидтерінің бар екенін көрсетті.Алынған нәтижелерді авторлар былай түсіндірді;құйылысқан протопластардан шыққан ала жапырақты өсімдіктер хлорофилдің жетіспеушілігін белгілейтін хлоропласт гендеері бойынша және АуБФК-ның үлкен бөлігінің құрылымын белгілейтін хлоропласт гендері бойынша гетерозиготалық өсімдіктер болғаны.Бұл гетгрозиталық сомалық будандастырудағы ата-аналардың цитоплазмасы «будандасып» және цитоплазмалық гендері олардың екеуінде тұқым қуалацу салдарынан туындайды.

Сонымен қатар ,митохондриялық ДНҚ-жазылған цитоплазмалық аталық ұрықсыздық белгісі ата-ананың біреуінен тұқым қуалаған,яғни гомозиготалы болған.6-алажапырақты регенерант өсімдіктердің тек біреуі ғана,шамасы,нағыз будан болған жапырақ құрылымы аралық формалы болған және гүл құрылымы осы слрттардың жыныстық будандарына ұқсас болған.Диплойдтық өсімдіктер морфология жағынан  Дюбек 44 сортының өсімдіктерінен айнымаған.Шамамен олар Самсун сортының ядролары жойылып кеткен гетерокарионнан шыққан.

Сонымен ,бұл тәжірибелер протопластарды қосып өсімдіктерді будандастыру кезінде ата-аналарының кейбір цитоплазмалық гендері екеуіненде тұқым қуалайтынын анық дәлелдеді.Бұл құбылыс түр аралық будандастыруда орын алады.

Митоздық көбею кезінде плазмогендердің сегрегациясы орын алады.Қорытындыда қайсы сы болсада плазмогенннен ата-ананың таза формасы шығуы тиіс (егер рекомбинация өтпесе) көптеген будан өсімдіктерде пластидтерін зерттеген барлық жұмыстарда ата-ана екеуінің де таза пластидтерінің пайда болуы байқалған.Бұл цитоплазмалық гетерозиготаларда сегрегацияның кездейсоқ өтуін және осы оргонойд деңгейінде селекция қысымының болмағандығын көрсетеді.Сегрегация процесінде пластидтік ДНҚ жазылған белгілер (пластидтік хлорофил ақауы,стрептомицинге ,тентоксинге ,атразинге төзімділік,РуБФК-ның үлкен бөлшегінің полтпептидтік құрылымы хлоропластық ДНҚ рестриктік спектрлері ) топтасып жойылады.Мүмкін сомалық будандарда ата-аналардың хлоропластары түсіп қалуына,протопластардың қосылуына,сұрыпталуына және регенерациясына леспелі фокторлар күшті әсер етеді.

Сомалық будандардың митохондриялық ДНҚ және онда жзылған белгілерін зерттегенде мүлдем басқаны көрсеткен.Бұл белгілердің сғегрегациясы күрделі өтеді,соның нәтижесінде белгілі екі таза ата-ана формаларынан басқа көптеген тұрақты формалар пайда болады.Бұл құбылысты  будан клеткаларда өтіп жатқан түрлі оқиғалар арқасында түсінуге болады.

1.ата-аналардың ДНҚ арасындағы әрекеттесуі нәтижесінде екеуінің де нуклеотид тізбегі бар рекомбинанттық  ДНҚ пайда болуы.

2.жоғары сактыдағы өсімдіктердің ДНҚ гетерогендік болғандықтан будан клетка бөлінгенде ДНҚ бұрын ата-аналарда білінбеген минорлық фракциясы басым бөлініп,көріне бастайды.Сонымен қатар түр ішіндегі молекула аралық рекомбинациялар және молекула аралық қайта құрулар өтуі мүмкін.Цитоплазма будандарының ДНҚ биохимиялық талдау көрсеткеніндей митохондриялық геномдарында рекомбинация жүреді. Осы және кейінгі тәжірибелер анық дәлелдеген мынадай тұжырымдар туды;

1.Сомалық будандарда  пластом белгілері толық косегрегацияға ұшырайды.

2.Пластомның генетикалық рекомбинациясы өте сирек кездеседі.

3.Митохондриялық ДНҚ рекомбинанттық түрі өте жиі кездеседі.

4.Митохондрионның пластомға тәуелсіз өз бетімен сегрегациясы өте береді.Сонымен сомалық будандастыруда ДНҚ ерекшелігіне сай  айырмашылықтары,яғни жыныстық процесіне қарама-қарсы ДНҚ әжептеуір өзгеріске тап болады.

Жат текті түрлерді сомалық будандастыру                                                                                                                                                    

Әрқилы тұқымдастар,трибалар (тұқымдас пен туыс аралығындағы жүйелеу бірлігі) және туыстар құрамына кіретін бір-біріне жат түрлер арасында жыныстық жолмен будан алу мүмкін емес.Филогенезге түпкі тектері алшақ жатқан түрлер арасынан тек сомалық буданды,олардың протопластарын қосып алуға болады.Бірақ осы кезге шейін ондай сомалық будандардан құнды ұрпақты өсімдіктер әлі алынған жоқ.Мысалы,ғалымдар мынадай тұқымдасаралық будан клеткалардан линиялар алған:соя мен темекінің каллус пен мезофилл протопластарың қосып; бұршақ пен темекінің ;ат бұршағы мен темекінің ;темекінің ;темекі мен пияздың және т.с.с.Осы тұқымдасаралық клеткалық будандардың клондары зерттеледі.Барлығында қысқа мерзімде мезофилл клеткасының хромосомалары жойыла бастаған.Цитогенетикалық талдау мен изоферменттердің құрамын талдау көрсеткендей,хромосомалар толық жойылмаған.Тұқымдасаралық будан клеткалар арасында көпядролық немесе өте кіші клеткалар,хромосомалық қайта құру,алып хромосомалар көп байқалған.Тек темекі мен ат бұршағы арасындағы будан клеткаларда морфогенез индукциялау арқасында сабаққа ұқсас кемтар құрылымдар пайда болған.Бір тұқымдасқа қарайтын түрлердің будандарын алғанда,яғни трибааралық және туысаралық будандармен өткізген тәжірибелердің нәтижесі жөндірек болған. Бұндай будандар алқа,кресгүлдер және шатыршагүлділер тұқымдастарында алынған.

1978 жылы Ю.Ю.Глеба мен Ф.Хорфман арабидопсистың каллус протопластарын турненстың мезофилл протопластарымен қосып сомалық будан алды.Бұл өсімдіктер кресгүлділер тұқымдасының әр түрлі трибаларына жатады.Будан клеткалар линияларында цитологиялық талдау көрсеткендей,екі түрдің де хромосомаларлары жойылмаған,дегенмен хромосомаларда қайта құру өткен.Клеткалардың екі линиясында морфогнез жүргізіліп,регенерант өсімдіктері алынған.Олар морфология жағынан арабидопсиске де,турненске де ұқсас болған.Бірақ бұл нормалы өсімдіктер емес еді,олар гүлдеген жоқ.Цитологиялық,биохимиялық және морфологиялық талдау өткізгенде,будан өсімдіктерде екі түрдің де генетикалық материалы болғаны дәлелденді.Ал араидопсис пен турнепстің In vitro